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血清脂蛋白的實(shí)驗(yàn)操作

更新時(shí)間:2015-10-23 點(diǎn)擊量:2213

    原理:將血清脂蛋白用脂類染料(如蘇丹黑或油紅O等)進(jìn)行預(yù)染。再將預(yù)染過的血清置于瓊脂糖凝膠板上進(jìn)行電泳分離。通電后,脂蛋白向正極移動(dòng),并分離為幾個(gè)區(qū)帶。

操作:

.預(yù)染血清:血清0.2ml加蘇丹黑染色液0.2ml于小試管中,混合后置37℃水浴染色30分鐘,然后離心(2000轉(zhuǎn)/分,約5分鐘)。

2.制備瓊脂糖凝膠板:將已配制的0.45%瓊脂糖凝膠于沸水浴中加熱融化,用吸管吸取凝膠溶液澆注載玻片,每片2.5ml,靜置約半小時(shí)后凝固(天熱時(shí)需延長(zhǎng),可放冰箱數(shù)分鐘加速凝固)。

3.點(diǎn)加血清:已凝固的瓊脂糖凝膠板的一端約2cm處,用切口刀片垂直切入凝膠后立即取出,然后用銅絲小匙將長(zhǎng)方小條凝膠取出。以小片濾紙吸干小槽中水分,用血色素吸管吸取經(jīng)過預(yù)染的血清約5μl,注入凝膠板上的小槽內(nèi)。

4.電泳:將加過血清的凝膠板平行放入電泳槽中,樣品應(yīng)在陰極一端。兩塊三層紗布于緩沖液中浸潤(rùn),然后輕輕緊密貼在凝膠板兩端,紗布的另一端浸于電泳槽內(nèi)的緩沖液(注意:此電極緩沖液不能用三羥甲烷緩沖液代替)。接通電源,電壓為20~30V,每片電流為3~4mA。約經(jīng)電泳5至55分鐘,即可見分離之色帶。

結(jié)果及臨床意義:

.正常人血清脂蛋白可出現(xiàn)三條區(qū)帶,從負(fù)極到正極依次為β-脂蛋白(zui深)、前β-脂蛋白(zui淺)、α-脂蛋白(比前β-脂蛋白略深些),在原點(diǎn)處應(yīng)無(wú)乳糜微粒。

2.如果前β-脂蛋白比α-脂蛋白深,結(jié)合血清甘油三酯明顯升高和正常或略高,可以定為Ⅳ型高脂蛋白血癥。

3.如果β-脂蛋白區(qū)帶比正常血清明顯深染者,同時(shí)結(jié)合血清總明顯增高、甘油三酯正常者為Ⅱa型;若結(jié)合血清總增高而甘油三酯略高的前β略溶者為Ⅱb型。

4.結(jié)果β-和前β-兩區(qū)帶分離不開連在一起稱“寬β區(qū)帶",結(jié)合血清甘油三酯和均有所增高,可定為Ⅲ型。

5.如果原點(diǎn)出現(xiàn)乳糜微粒,β,前β均正常或減低,結(jié)合血清甘油三酯明顯升高,可定為Ⅰ型。

注意事項(xiàng):

.電泳樣品要求為新鮮的空腹血清。

2.每一塊凝膠上可平行挖兩條小槽,因而可加兩個(gè)樣品。

3.如果用一形狀大小和小槽一樣的有機(jī)玻璃片,在瓊脂糖膠凝固前固定于適當(dāng)位子上,當(dāng)凝固后取出有機(jī)玻璃片,凝膠板上留下小槽可直接加樣,不需挖槽。

4.如果需要保留電泳樣本,可將電泳后之凝膠板(連同玻片)放于清水中浸泡脫鹽2小時(shí),然后放烘箱(80℃左右)烘干即可。蛋白

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