細(xì)胞培養(yǎng)基制備原材料需要及裂解液的制備

    細(xì)胞培養(yǎng)基的制備工作涉及物理、化學(xué)和生物等各方面知識(shí)，但基本原理不外乎兩方面。一是得用混合物中幾個(gè)組分分配率的差別，把它們分配到可用機(jī)械方法分離的兩個(gè)或幾個(gè)物相中，如鹽析，有機(jī)溶劑提取，層析和結(jié)晶等；二是將混合物置于單一物相中，通過物理力場(chǎng)的作用使各組分分配于來同區(qū)域而達(dá)到分離目的，如電泳，超速離心，超濾等。在所有這些方法的應(yīng)用中必須注意保存生物大分子的完整性，防止酸、鹼、高溫，劇烈機(jī)械作用而導(dǎo)致所提物質(zhì)生物活性的喪失。細(xì)胞培養(yǎng)基的制備一般分為以下四個(gè)階段：選擇材料和預(yù)處理，細(xì)胞的破碎及細(xì)胞器的分離，提取和純化，濃細(xì)、干燥和保存。

　　微生物、植物和動(dòng)物都可做為制備細(xì)胞培養(yǎng)基的原材料，所選用的材料主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩泶_定。對(duì)于微生物，應(yīng)注意它的生，在微生物的對(duì)數(shù)生，酶和核酸的含量較高，可以獲得高產(chǎn)量，以微生物為材料時(shí)有兩種情況：（）得用微生物菌體分泌到培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物和胞外酶等；（2）利用菌體含有的生化物質(zhì)，如細(xì)胞培養(yǎng)基、核酸和胞內(nèi)酶等。植物材料必須經(jīng)過去殼，脫脂并注意植物品種和生長(zhǎng)發(fā)育狀況不同，其中所含生物大分子的量變化很大，另外與季節(jié)性關(guān)系密切。對(duì)動(dòng)物組織，必須選擇有效成份含量豐富的臟器組織為原材料，先進(jìn)行絞碎、脫脂等處理。另外，對(duì)預(yù)處理好的材料，若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)冷凍保存，對(duì)于易分解的生物大分子應(yīng)選用新鮮材料制備。

裂解液的制備步驟：

    、將長(zhǎng)滿細(xì)胞的培養(yǎng)基瓶放置在冰上，用吸液管吸出培養(yǎng)液。加入足夠的冷的PBS在培養(yǎng)瓶中充分洗滌細(xì)胞表面，以洗去瓶中殘留的培養(yǎng)基，倒掉PBS ，重復(fù)以上操作2-3遍。在zui后一次洗滌中盡可能吸干殘留的PBS，盡量在冰上操作。

　　2、向培養(yǎng)瓶中加入冷的RIPA 裂解緩沖液(每75cm2 培養(yǎng)瓶加ml). 然后用細(xì)胞刮子沿著瓶壁開始刮細(xì)胞，如果所需要刮的同種細(xì)胞有多瓶，則將*瓶刮下的細(xì)胞液吸出轉(zhuǎn)入下一瓶中繼續(xù)刮(由于處理后的細(xì)胞裂解液較粘稠，所以宜用直徑大點(diǎn)的吸液管吸取)。

　　3、吸出刮好的細(xì)胞裂解液置于4ml 離心管中（置于冰上），然后重復(fù)步驟2以刮取剩下的細(xì)胞。

　　4、盡可能將多的細(xì)胞培養(yǎng)基裂解液收集到4ml的離心管中，樣品插入冰盒進(jìn)行超聲，超聲強(qiáng)度以不產(chǎn)生泡沫為準(zhǔn)，超聲每次2-3秒，重復(fù)3-4次。如仍有細(xì)胞碎片或沉淀，應(yīng)離心0000rpm,0分鐘，留取上清。

　　5、取出小量細(xì)胞裂解液測(cè)其蛋白濃度（用Biorad Bradford 試劑盒或紫外分光光度計(jì)，在A280測(cè)定），分裝保存在-70℃。