莽草酸脫氫酶(SD)測試盒操作步驟

1. 樣本預處理

取0.2g新鮮植物組織置于預冷的研缽中，加入1.5mL 0.1M磷酸緩沖液（pH7.5）冰浴研磨，4℃條件下12000rpm離心15分鐘，上清液即為粗酶提取液。注意：所有操作需在冰上完成，避免酶活性損失。

2. 反應體系構建

在1.5mL離心管中依次加入：

- 650μL 0.1M Tris-HCl緩沖液（pH8.0）

- 100μL 10mM NAD+

- 50μL 粗酶提取液

輕輕混勻后37℃水浴預熱5分鐘，設置空白對照組（用緩沖液替代酶液）。

3. 反應啟動與監(jiān)測

加入200μL 20mM莽草酸溶液啟動反應，立即轉(zhuǎn)移至分光光度計比色皿。在340nm波長下，每30秒記錄一次吸光度值，持續(xù)監(jiān)測10分鐘。建議使用帶恒溫裝置的分光光度計保持37℃測定環(huán)境。

4. 關鍵注意事項

（1）反應線性期判定：選擇OD值變化呈直線的時間段（通常為前4分鐘）計算酶活，R2應＞0.98；

（2）干擾排除：若樣本含色素，需增設不加NAD+的對照管扣除本底；

（3）酶活計算：ΔA/min×反應體系總體積（μL）×稀釋倍數(shù)/（6.22×光程cm×取樣量μL），結果以U/g FW表示。

【常見問題解決方案】

- 反應速率過低：檢查NAD+試劑是否失效，或嘗試提高酶液濃度；

- 曲線非線性：可能樣本中代謝物干擾，建議超濾純化酶液；

- 數(shù)據(jù)波動大：確認比色皿清潔度，避免氣泡干擾。